أعلى 3 خطوات متسلسلة من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

توضح النقاط التالية أهم ثلاث خطوات متتالية من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). الخطوات المتسلسلة هي: تغيير الشكل 2. التليين 3. تمديد الحمض النووي.

خطوة متسلسلة # 1. تغيير طبيعة:

وتتمثل الخطوة الأولى في تفسخ الحمض النووي (DNA الأولي (DNA الأولي والحمض النووي الأصلي)). يُعرف الفصل بين سلالتين من الحمض النووي (DNA) بأنه تغيير اللون ، في حين يُطلق على وضعَي حامل معاً اسم إعادة التلدين أو التهجين (الشكل 48.1). تم اكتشاف اكتشاف التشوه وإعادة تلدين الحمض النووي بشكل اصطناعي من قبل مارمور ولين (1960).

وفقا لها ، يمكن فصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل إلى اثنين من فروع منفصلة واحدة (تغيير طبيعة) عن طريق التسخين عند درجة حرارة عالية (90-95 درجة مئوية) والتهجين أو الانضمام من اثنين من الحمض النووي (الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل) وهو ممكن من قبل خفض درجة الحرارة (50-56 درجة مئوية).

هذا هو المبدأ الرئيسي الذي يعمل عليه PCR. المبدأ الثاني هو تمديد التمهيدي بمساعدة إنزيم بوليميريز الدنا.

يضاف الحمض النووي الأصلي ، البادئ و DNA إنزيم polymerase (Tag polymerase) في أنبوب PCR ويتم رفع درجة الحرارة وخفضها في جهاز PCR لتهويدها وتهجينها.

خطوة متسلسلة # 2.التليين:

بعد تغيير طبيعة الحمض النووي (DNA) ، فإن الخطوة التالية هي السماح للبرايمر المركب بالصلاب إلى فروع الحمض النووي المقابلة من التسلسل الهدف المرغوب. يمكن أن يحدث التلدين (التهجين) إذا تم خفض درجة الحرارة من 95 درجة مئوية إلى 50/56 درجة مئوية. ثم يتم إسقاط درجة الحرارة في الجهاز.

حالما يتم تخفيض درجة الحرارة ، فإن خيوط الحمض النووي الأصلية لن تربط بعضها البعض فحسب ، بل ترتبط أيضًا بالدعامات. هذا التهجين المحدد ، أو "إعادة التركيب" من النيوكليوتيدات التكميلية ، يوفر الأساس المنطقي والأساس العملي لكثير من الحمض النووي المؤتلف (الشكل 48.2).

متسلسل الخطوة رقم 3. تمديد الحمض النووي (هناك حاجة إلى أنزيم بوليمريز طق):

بعد أن يبدأ الصدأ في التمدد ، يجب تمديده باستخدام التمهيدي قليل النوكليوتيد كنقطة انطلاق. وصف أن إنزيم بوليميريز الحمض النووي ضروري لتوليف الحمض النووي. لذلك ، لتمديد التمهيدي نحتاج إلى بوليمراز DNA مستقر حراري بحيث لا يتم تدمير الإنزيم في درجة حرارة عالية.

يتم عزل polymerase مستقرة (طق بوليميريز) من Thermus aquaticus. إن polymeq Taq له ميزة هائلة في إجراء تفاعل PCR. لديه درجة حرارة نشاط مثالية تبلغ حوالي 70 درجة مئوية ولا يجب إضافة إنزيم جديد إلى كل أنبوب اختبار بعد عملية التسخين والتبريد.

يتم تصنيع بوليميريز الحمض النووي المستقر الآن من قبل شركات مختلفة بمصادر مختلفة (بخلاف Thermus aquaticus) تحت أسماء تجارية مختلفة (TM). لتمديد التمهيدي ، يضاف بوليمراز الحمض النووي المستقر الحراري في الأنبوب ثم ترتفع درجة الحرارة إلى 65-70 درجة مئوية.

تضمن الدورات اللاحقة لفصل الحبلا (تغيير المنشأ) والتهجين الأولي (التلدين) وتوليف الجدائل (التمديد) تضخيمًا أسيًا للتسلسلات المستهدفة باستخدام التسلسل المتضخم إذا كانت الدورة السابقة كقالب جديد ، هناك ثلاث دورات (الشكل 48.2 ).

صنع التمهيدي:

تستخدم الاشعال القصيرة (غالباً RNA) لصنع اثنين من النيوكليوتيدات ، يشار إلى التمهيدي ، مع واحد لكل نهاية من شظية الحمض النووي ويوفر نهاية 3 -OH مجانية عندها يبدأ بوليميراز الحمض النووي توليف سلسلة deoxyribonucleotide.

يتم إجراء تسلسل واحد في اتجاه الإحساس ، في حين يتم إجراء الآخر في الاتجاه المعاكس للإحساس. (الشكل 48.2). يستخدم التمهيدي لتجهيز تركيبة أشرطة الحمض النووي المجانية ومصممة بحيث يكون الدنا بين البادئات هو جزء الاهتمام الذي يجب تضخيمه.

إذا تم تضخيم الحمض النووي الريبي (mRNA) المرسال ، فيجب تحويله إلى DNA مجاني (cDNA) بواسطة بوليميراز الدنا المعتمد على RNA ، الناسخ العكسي. ثم يتم تغيير مجمع [كدنا] إلى الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، أن تصبح قالب لتفاعل PCR اللاحقة.

هذا هو المعروف في كثير من الأحيان رد فعل سلسلة البوليمرية ترانسكريبتيراز معكوس (RT PCR). يمكن إنشاء بادئات اصطناعية أو يمكن شراؤها من الشركات.

بعد اكتمال التفاعل ، يمكن تصور المنتجات المضخمة (DNA) عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. الخاصية المادية الهامة لجزيء الحمض النووي هي أن كل نوكليوتيد فردي يمتلك شحنة سالبة صافية ناتجة عن مجموعة الفوسفات.

وهكذا تميل الشظايا ذات الأحجام المختلفة التي تتعرض إلى حقل كهربائي للهجرة نحو القطب الموجب بمعدل مختلف تبعاً للحجم ، مع شظايا صغيرة تهاجر أسرع من الأكبر. تسمى عملية الفصل هذه التي تعتمد على شحنة كهربائية الرحلان الكهربي.

تضاف عينات الحمض النووي ، بعد أن يتم هضمها إلى شظايا ذات أحجام مختلفة بواسطة إنزيم تقييد (endonuclease) ، إلى وسط دعم مثل هلام agrose أو acrylamide. وتعتمد مسامات الهلام على نسبتها ويمكن مقارنتها بمنخل (جزيئي). وبالتالي ، فإن سرعة انتقال شظايا الحمض النووي من خلال الهلام تعتمد على كل من حجم شظايا الحمض النووي والجهد المطبق.

إجراء فصل وخصم جزء معين من الحمض النووي هو النشاف الجنوبي. تكمن أهمية هذه التقنية في أنه يمكن نقل شظية حبلا واحدة بواسطة عمل شعري إلى وسط دعم صلب (غشاء نايلون أو سليلوز) ويتم تثبيته بشكل دائم عن طريق التسخين (الشكل 48.3).

بعد الرحلان الكهربي ، يمكن تصور نمط الحمض النووي تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية بعد المعالجة ببقع بروميد الإيثيديوم ؛ بروميد إيثيديوم هو صبغة الفلورسنت. تتميّز شظايا الرحلان الكهربائيّة الهلّاميّة بزخارف مميزة من 100 زوج قاعدي إلى 60000 زوج قاعدي (60 كيلوبايت) ، في حين أنّ جزيئات البولي أكريلاميد تفصل الشظايا فعليًا عن 1000 زوج من القواعد (1 كيلوبايت).

لقد جعل الرحلان الكهربائي للهلام (PFGE) من الممكن فصل شظايا الحمض النووي حتى 2kb. في هذا الإجراء ، يتم تغيير الحقل الكهربائي في اتجاهات مختلفة مما يدفع جزيئات الدنا إلى إعادة التوجيه بين كل نبضة أو تيار كهربائي. هذا هو أفضل تقنية لتحديد الجين المعروف.

يمكن لل endonucleases التعرف على 3،4،5،6 أو 8 أزواج قاعدة وتتوفر في السوق.

مخازن PCR / الأملاح.

بالنسبة لبوليميراز الحمض النووي Taq ، يتم عمل المخزن المؤقت على النحو التالي:

50 ملي كى سي

10 ملم تريس - HCI في درجة حرارة الغرفة

يتم استخدام ثنائي ميثيل السلفوكسيد (DMSO) والجلايكول كمذيب مشترك في مخازن PCR عندما يكون الهدف ذو درجة حرارة تمسخ عالية جدًا.

Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) هو العامل المساعد الأيوني.

تقدم شركات التكنولوجيا الحيوية حاليًا حلولًا جاهزة.

يتم وصف المبدأ الأساسي على النحو التالي:

هناك أربعة dNTPs وهي DATP (adenine triphosphate) ، dCTP (cytosine) ، dGTP (gunine) ، dUTP (uracil) التي يتم استخدامها وفقًا لقواعد الزوج الأساسي لتوسيع التمهيدي ، وفي النهاية لنسخ التسلسل الهدف.

يرتبط dNTP بـ Mg ²⁺ . إن كمية dNTPs الموجودة في التفاعل سوف تحدد كمية Mg ²⁺ المجانية المتاحة لنشاط الإنزيم الأمثل. يجب تحييد حلول dNTP للأسهم مع قاعدة تريس إلى درجة حموضة 7.0 وينبغي تحديد تركيزها طيفيًا.

الركيزة والرقم القياسي النظير:

عمل البلمرة طق (dNTP) بشكل فعال جدا. ومع ذلك ، هناك بعض الركائز المعدلة المتاحة بدلا من طبقة بوليميريز الحمض النووي Tag. هم dogoxigenin- dNTP ، biotin-11-dUTP ، C7deaza-dGTP ، و dNTPS fluorescently المسمى.

الأنواع التالية من PCR هي الاستخدام العام:

(1) PCR المتداخل ؛

(2) RT-PCR ؛

(3) مرساة PCR.

(4) PCR غير المتناظر.

(5) PCR معكوس ؛

(6) DOP-PCR.