تجربة على أداء تلطيخ سريع حامض من البكتيريا

تجربة على تنفيذ تلطيخ سريع للحمض من البكتيريا لمعرفة ما إذا كان حامض سريع أو غير حامض سريع!

غرض:

يمكن تلطيخ معظم البكتيريا ، إما عن طريق تلطيخ أساسي بسيط أو عن طريق تلطيخ جرام ، حيث تأخذ خلاياها البقع بسهولة.

ومع ذلك ، فإن بعض البكتيريا تمتلك جدارًا خلويًا شمعيًا سميكًا مصنوعًا من مواد دهنية.

من الصعب للغاية صبغ هذه البكتيريا ، حيث لا يمكن للبقع المائية العادية الدخول بسهولة إلى خلاياها ، ولكن بمجرد صبغها ؛ ومن الصعب أيضًا إزالة البقع من خلاياه ، حتى مع الاستخدام القوي للكحول الحمضي كعامل إزالة التصبغ. هذه البكتريا ملطخة بالتلوين الحمضي السريع.

وهكذا ، فإن تلطيخ الحموضة بسرعة ، على غرار تلطيخ غرام ، هو طريقة تلطيخ تفاضلي ، والتي تميز البكتيريا ، استنادا إلى طبيعة جدار الخلية ، إلى مجموعتين على النحو التالي:

(1) البكتيريا سريع الحمض:

البكتيريا ، التي يصعب تلوينها بشدة ، ولكن بمجرد صبغها ، يكون من الصعب أيضًا إزالة البقع من خلاياه ، حتى مع الاستخدام القوي للكحول الحمضي كعامل إزالة الكوليسترول ، وهي بكتيريا سريعة الحموضة (محبة للحمض) بكتيريا).

أمثلة: Mycobacterium spp. [M. السل (بكتيريا السل) ، M. leprae (بكتيريا الجذام) ، M. smegmatis (البكتيريا الطبيعية من smegma) و M. marinum (بكتيريا السل من الأسماك البحرية). أنها تمتلك جدار خلية شمعية سميكة مصنوعة من مواد الدهون.

(2) البكتيريا غير الحمضية السريعة:

البكتيريا ، التي يسهل صبغها ويسهل إزالتها عن طريق الكحول الحمضي كعامل إزالة الكوليسترول ، هي بكتيريا سريعة الحموضة (بكتيريا غير محببة للحمض). أمثلة: جميع البكتيريا باستثناء المتفطرة spp. في هذه البكتيريا ، جدار الخلية ليست سميكة وشمعية.

التلطيخ سريع الحمض مفيد في تمييز البكتريا ذات الأحماض السريعة وغير الحامضية السريعة وكذلك في تحديد البكتيريا التي تنتمي إلى جنس المتفطرة.

المبدأ:

تختلف البكتيريا سريعة الحمض عن البكتيريا غير الحمضية السريعة في ذلك ، فهي تمتلك جدارًا خلويًا شمعيًا سميكًا مصنوعًا من مواد دهنية. لا يمكن للبقع المائية العادية ، مثل الأزرق المثيلين أو البنفسجي البلوري ، الدخول إلى خلاياها من خلال جدار الخلية الشمعي هذا.

ومع ذلك ، فإن أحمر اللون الفينول الأساسية فينيل carbol fuchsin (حمض carbolic أو الفينول + fuchsine الأساسية) ؛ وهو قابل للذوبان في المواد الدهنية لجدار الخلية ، يمكن أن يدخل إلى خلاياها من خلال جدار الخلية ويمكن الاحتفاظ بها داخل الخلايا التي تنقل اللون الأحمر إليها.

يتم زيادة الاختراق عن طريق تطبيق الحرارة ، والتي تدفع carc fuchsine من خلال جدار الشحمية في السيتوبلازم. (يصف التعديل الطفيف لهذه الطريقة Ziel- Neelsen إضافة عامل ترطيب ، Turgitol ، إلى البقعة ، مما يقلل من التوتر السطحي بين جدار الخلية والبقعة ، مما يتطلب عدم التسخين). يسمح للخلايا أن تبرد ، وذلك لتصلب جدار الخلية الشمعية.

عندما تتعرض الخلايا لعامل إزالة الكوليسترول ، حمض الكحوليات ، فإنها تقاوم إزالة اللون ، حيث أن البقعة الأولية أكثر قابلية للذوبان في الشموع الخلوية منها في عامل إزالة اللون. في وقت لاحق ، عندما لا تكون ملوثة بالميثيلين الأزرق ، فإنه لا يمكن الدخول إلى الخلايا من خلال جدار الخلية الشمعية.

وهكذا ، فإن البكتيريا سريعة الحمض تحافظ على اللون الأحمر للبقعة الأولية وتظهر باللون الأحمر. من ناحية أخرى ، فإن البكتريا غير الحامضية السريعة تلتهم البقعة الأولية بسهولة وتخضع لعملية إزالة اللون بسهولة. عندما تتلوث هذه الخلايا باللون الأزرق الميثيلين ، فإن هذه الخلايا عديمة اللون تشغل بسهولة وصمة عار مضادة للبقع وتظهر بلون أزرق ، على عكس البكتيريا سريعة الحموضة ، التي تظهر باللون الأحمر.

المواد المطلوبة:

الشرائح ، حلقة ، البقعة الأولية (carbol fuchsine) ، عامل إزالة اللون (حمض-كحول) ، وصمة مضادة (ميثيلين الأزرق) ، صفيحة ساخنة ، مرق / مائلة / لوحة ثقافة البكتيريا ، المجهر ، زيت الغمر.

إجراء:

1. يتم تنظيف الشريحة بشكل صحيح تحت ماء الصنبور ، بحيث لا تبقى المياه كقطرات على سطحها (شكل 5.12).

2. تمسح المياه الملتصقة بها مع ورقة ماص وشريحة الهواء المجفف.

3. يتم تحضير لطخة البكتيريا في مركز الشريحة في طريقتين على النحو التالي.

(أ) إذا لوحظت البكتيريا التي تنمو على صفيحة أجار أو مائلة أجار ، يتم وضع قطرة ماء في مركز الشريحة ويتم نقل حلقة من البكتيريا من الصفيحة أو الميل إليها بواسطة حلقة معقمة على لهب . ثم ، عن طريق الدوران البطيء للحلقة في الهبوط ، يتم إجراء تعليق البكتيريا وينتشر حتى يتم الحصول على اللطاخة.

(ب) إذا لوحظت البكتيريا التي تنمو في مرق السائل ، يتم وضع قطرة من تعليق البكتيريا مباشرة في مركز الشريحة عن طريق حلقة تعقيم اللهب ويتم إجراء تشويه عن طريق الانتشار.

4. لطاخة الهواء المجفف.

5. يتم إصلاح لطخة بالتسخين. ينتج التسخين عن تخثر البروتينات الخلوية ، التي تلتصق بها الخلايا على سطح الشريحة ولا تغسل أثناء التلطيخ. يتم التثبيت الحراري عن طريق تمرير الشريحة بسرعة عالية فوق اللهب من 2-3 مرات ، مع مواجهة سطح اللطخة لأعلى ، بحيث لا يتم تسخين اللطخة.

6. غمرت اللطخة مع carbol fuchsin

7. يتم وضع الشريحة على لوح ساخن دافئ ، مما يسمح بإعداد البخار لمدة 5 دقائق. يتم ضبط درجة حرارة الصفيحة الساخنة بحيث لا يغلي المزيج ويتبخر بسرعة. يتم تجديد فقدان التبخر ، بحيث لا تجف اللطاخة. (لطريقة الحرارة ، تغمر اللطخة لمدة 3-5 دقائق مع carbol fuchsin التي تحتوي على Turgitol).

8. تتم إزالة الشريحة من لوحة الساخنة وتبرد.

9. يتم غسل اللطخة الزائدة بعيدا عن اللطاخة تحت ماء الحنفية المتدفق بلطف ، بحيث لا يقع الماء مباشرة على اللطاخة.

10. يتم إضافة عامل إزالة اللون ، كحول الحمض ، على انخفاض اللطخة عن طريق القطرة ، حتى يفشل carbol fuchsin في الغسل من اللطاخة.

11. يتم غسل الكحوليات الحمضية بعيدًا عن اللطاخة تحت ماء الحنفية المتدفق بلطف ، بحيث لا يسقط الماء مباشرة على اللطاخة.

12. يتم إغراق اللطخة بالبقع المضاد ، الأزرق المثيلين ، لمدة دقيقتين.

13. يتم غسلها وصمة عار المضاد بعيدا عن اللطاخة تحت ماء الصنبور المتدفق بلطف ، بحيث لا يقع الماء مباشرة على اللطاخة.

14. يتم تحريك الشريحة الجافة مع ورقة ماصّة.

15. يتم قص الشريحة إلى مرحلة المجهر والمسحة التي لوحظت في ظل انخفاض القوة والأهداف الجافة العالية.

16. يتم وضع قطرة من زيت الغمر على اللطاخة.

17. لوحظ اللطاخة تحت الهدف الغمر بالنفط.