تجربة لأداء تلطيخ الجرام من البكتيريا (مع الشكل)

قراءة هذه المادة لمعرفة المزيد عن تجربة لأداء تلطيخ جرام من البكتيريا لمعرفة ما إذا كانت سلبية أو سلبية الغرام!

غرض:

أهم تلطيخ تفاضلي يستخدم في علم الأحياء الدقيقة هو تلطيخ غرام.

سميت بعد الدكتور كريستيان غرام الذي صنف البكتيريا ، استنادا إلى الاختلافات في تكوين جدار الخلية ، إلى مجموعتين على النحو التالي:

(1) البكتيريا إيجابية الغرام:

بعد تلطيخ البكتيريا مع البنفسج البلوري ، إذا كان جدار الخلية يقاوم إزالة اللون عن طريق الغسل مع عامل إزالة اللون (الإيثانول أو الأسيتون) ، فهو بكتيريا إيجابية الجرام. أمثلة: Bacillus ، Staphylococcus.

(2) البكتيريا سالبة الجرام:

بعد تلطيخ البكتيريا مع البنفسج البلوري ، إذا كان جدار الخلية يسمح للخضوع لتصفية اللون عن طريق الغسل مع عامل إزالة اللون (الإيثانول أو الأسيتون) ، فإنه من البكتيريا سالبة الجرام. أمثلة: Escherichia، Salmonella، Vibrio.

يوفر التمايز البكتيريا إلى مجموعات إيجابية الغرام والسالبة الجرام أهم فكرة للمضي قدما في الاتجاه الصحيح لتحديد البكتيريا غير معروفة. ومن المفيد أيضا للتمييز البسيط للبكتيريا في مجموعات إيجابية الغرام والسالبة. كما يعطي فكرة عن شكل وترتيب الخلايا البكتيرية.

المبدأ:

في تلطيخ جرام ، يتم تلطيخ خلايا البكتيريا لأول مرة مع البقع الأولية ، والبنفسجي الكريستال الذي يدخل في الخلايا وصبغها باللون الأزرق الأرجواني. ثم يتم علاج الخلايا باستخدام اليود ، وهو غرام اليود ، الذي يدخل في الخلايا ويربط إلى البقعة الأولية التي تشكل مركب الصبغ غير القابل للذوبان (معقد اليود البنفسجي البلوري) ، مما يجعل الهروب من البقعة أمرًا صعبًا.

بعد ذلك ، يتم التعامل مع الخلايا مع عامل إزالة اللون ، مثل الإيثانول أو الأسيتون. وهو يعمل كمذيب للدهون وكعامل بروتين التجفيف. في الخلايا إيجابية الجرام ، يعمل العامل decolourising في البداية كمذيب الدهون ، إذابة كمية قليلة من الدهون الموجودة في جدار الخلية ، وبالتالي تشكيل مسام دقيقة في ذلك. في وقت لاحق ، فإنه يجفف بروتينات جدار الخلية (الببتيدات) ، والتي تغلق المسام.

الآن ، من الصعب إزالة المعقد الصخري بواسطة عامل إزالة اللون ، وتحتفظ الخلايا باللون الأرجواني- الأزرق للبقعة الأولية. عندما تصطدم بطبقة بلون أحمر فاتح ، سافرانين ، لا يمكن دخولها إلى الخلايا ، حيث يتم إغلاق المسام.

في النهاية ، تحتفظ الخلايا باللون الأرجواني- الأزرق للبقعة الأولية. من ناحية أخرى ، يحتوي جدار الخلية سالبة الجرام على كمية كبيرة من الدهون (LPS) ، والتي يتم إذابتها بواسطة عامل إزالة اللون ، مما يؤدي إلى تكوين مسام كبيرة. هذه المسام لا تغلق بشكل ملحوظ على تجفيف بروتينات جدار الخلية.

ذلك هو السبب؛ يخرج مركب الصبغة عن طريق المسام ، عندما يغسله عامل إزالة اللون وتظهر الخلايا عديمة اللون. عندما يصبغه الصفاران ، فإنه يدخل إلى الخلايا عبر المسام ، وأخيراً تأخذ الخلايا اللون الوردي الأحمر من البقعة المضادة.

المواد المطلوبة:

الشرائح ، حلقة ، البقعة الأولية (الكريستال البنفسجي) ، بالحبر (اليود غرام) ، وكيل إزالة اللون (الإيثانول 95 ٪) ، وصمة عار (safranin) ، ثقافة مرق / مائلة / لوحة من البكتيريا ، المجهر ، زيت الغمر.

إجراء:

1. يتم تنظيف الشريحة بشكل صحيح تحت ماء الصنبور ، بحيث لا يبقى الماء كقطرات على سطحه (شكل 5.11).

2. تمسح المياه الملتصقة بها مع ورقة ماص وشريحة الهواء المجفف.

3. يتم تحضير لطخة البكتيريا في مركز الشريحة في طريقتين على النحو التالي.

(ا) إذا لوحظ وجود بكتيريا تنمو على صفيحة أجار أو ممر آغار ، يتم وضع قطرة ماء في مركز الشريحة ويتم نقل حلقة من البكتيريا من الصفيحة أو الميل إليها بواسطة حلقة معقمة فوق اللهب. ثم ، عن طريق الدوران البطيء للحلقة في الهبوط ، يتم إجراء تعليق البكتيريا وينتشر حتى يتم الحصول على اللطاخة.

(ب) إذا لوحظ وجود بكتيريا نمت في مرق السائل ، يتم وضع قطرة من تعليق البكتيريا مباشرة في مركز الشريحة عن طريق حلقة تعقيم اللهب ويتم إجراء تشويه عن طريق الانتشار.

4. لطاخة الهواء المجفف.

5. يتم إصلاح لطخة بالتسخين. ينتج التسخين عن تخثر البروتينات الخلوية ، التي تلتصق بها الخلايا على سطح الانزلاق ولا تغسل أثناء التلطيخ ، ويتم التثبيت بالحرارة عن طريق تمرير الشريحة بسرعة أعلى من اللهب 2-3 مرات ، مع اللطاخة السطح المتجه لأعلى ، بحيث لا يتم تسخين اللطخة.

6. يتم الاحتفاظ بالشريحة على علبة تلوين وتغمرها البقعة الأولية ، والبولي كريستال ، لمدة 1 دقيقة.

7. يتم غسل البقع الزائدة بعيدا عن اللطاخة تحت ماء الحنفية المتدفق بلطف ، بحيث لا يقع الماء مباشرة على اللطاخة.

8. تغمرها اللطخة مع اليود ، غرام اليود ، لمدة 1 دقيقة.

9. يتم غسلها الزائدة بعيدا عن اللطاخة تحت ماء الصنبور المتدفق بلطف ، بحيث لا يسقط الماء مباشرة على اللطاخة.

10. يتم إغراق اللطاخة بعامل إزالة اللون ، الإيثانول بنسبة 95 ٪ ، لمدة 5 ثوان ، مع الحرص ، بحيث لا يكون لطاخة الإفراط في تصفية اللطاخة.

11. يتم غسل الإيثانول بسرعة بعيدا عن اللطاخة تحت ماء الصنبور المتدفق بلطف ، وذلك لمنع الإفراط في إزالة اللون. يتم اتخاذ الحذر ، بحيث لا تقع المياه مباشرة على اللطاخة.

12. تغمرها اللطخة مع مكافحة وصمة عار ، safranin ، لمدة 1 دقيقة.

13. يتم غسلها وصمة عار المضاد بعيدا عن اللطاخة تحت ماء الصنبور المتدفق بلطف ، بحيث لا يقع الماء مباشرة على اللطاخة.

14. يتم تحريك الشريحة الجافة مع ورقة ماصّة.

15. يتم قص الشريحة إلى مرحلة المجهر والمسحة التي لوحظت في ظل انخفاض القوة والأهداف الجافة العالية.

16. يتم وضع قطرة من زيت الغمر على اللطاخة.

17. لوحظ اللطاخة تحت الهدف الغمر بالنفط.