تجربة لعزل Coliphage من فيروس (مع الرسم البياني)

تجربة لعزل Coliphage من فيروس!

المبدأ:

البكتيريا أو البكتيريا (الفيروس) التي تصيب البكتيريا ، تسمى الإشريكية القولونية coliphage (القولونية: E. coli- ، البكتيريا: bacteriophage).

يمكن الحصول عليها من مجموعة متنوعة من المصادر الطبيعية ، مثل التربة ، والبراز ، ومياه المجاري غير المعالجة. عزلتها عن هذه المصادر ليست سهلة للغاية ، لأنها موجودة في تركيز منخفض.

لذلك ، يتم أولاً زيادة عددها عن طريق خطوة تخصيب ، يتم فيها إضافة ثقافة غنية للبكتيريا المضيفة (أي بكتريا E. coli) إلى العينة المحتوية على الكولوفيه والمحتضنة. يصيب الكولاجيج الإشريكية القولونية ويزداد بغزارة. يتم طرد هذه الثراء الغنية بالمزيج لتهدئة الجسيمات.

يتم التخلص من الرواسب ويتم تصفية المادة الطافية من خلال مرشح الميكروبات للاحتفاظ بالبكتيريا والجسيمات الأخرى ، في حين تسمح لل coliphage بالمرور. يتم استخدام المرشح ، غني بالمبيضات ، لبذور معلق لل E. coli ، والذي يسمح له بالنمو كحشيقة متموجة على طبق أجار.

ينمو الخليط داخل خلايا الإشريكية القولونية ويغذيها. وينتج عن تحلل خلايا البكتيريا تكوين مناطق واضحة في الحديقة المتلاصقة للبكتيريا. تسمى هذه المناطق الصفيحة لويحات. من المفترض أن تكون كل منطقة شفافة قد تم تشكيلها بواسطة coliphage وحيد.

المواد المطلوبة:

ماصات ، قوارير مخروطية ، أطباق بتري ، أنابيب اختبار ، مقابس قطنية ، موقد بنزين ، جرة للتخلص ، جهاز طرد مركزي ، جهاز ترشيح غشائي ، غرفة تدفق الصفائح ، موصدة ، حاضنة ، مرق البكتيريا ، أجار تريبتوني ناعم ، أجار تريبتون الصلب ، ثقافة مرق المغذيات البكتيريا الإشريكية القولونية (على سبيل المثال ، E. coli B) ، عينة (على سبيل المثال ، مياه الصرف الصحي الخام).

إجراء:

1. يتم تعقيم خمسة ماصات (في حالة ماصة الفولاذ المقاوم للصدأ) وخمسة أطباق بتري في فرن الهواء الساخن عند 180 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. بدلا من ذلك ، يمكن تغطيتها بورق حبيبي ، مرتبطة مع خيط أو شريط مطاطي وتعقيمها في الأوتوكلاف جنبا إلى جنب مع وسائل الإعلام (الشكل 8.5).

2. يتم وزن مكونات مرق حبيبات البكتيريا المتوسطة أو مسحوقها الجاهز ، المطلوب من 100 مل من الوسط ، في 100 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي سعة 250 مل ودرجة حموضة مضبوطة إلى 7.6. القارورة موصولة بالقطن ومغطاة بورق حرفي ومربوطة بخيط أو شريط مطاطي.

3. يتم وزن مكونات وسط الأتربة الناعم تريبتوني أو مسحوقه الجاهز ، المطلوب من 100 مل من الوسط ، في 100 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي سعة 250 مل ودرجة حموضة مضبوطة إلى 7.5.

4. يتم توزيع هذه السائل على 5 أنابيب اختبار (2 مل لكل منهما) ، موصولة بالقطن ، مغطاة بورق حرفي ومربوطة بخيوط أو شريط مطاطي.

5. يتم وزن مكونات محلول آجار تريبتون الصلب أو مسحوقه الجاهز المطلوب لـ 100 مل من الوسط ويذوب في 100 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي سعة 250 مل بالتسخين بعد ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.5. القارورة موصولة بالقطن ومغطاة بورق حرفي ومربوطة بخيط أو شريط مطاطي.

6. إن القارورة المحتوية على مرق البكتيريا ، و 5 أجار تريبتوني لينة ، و القارورة التي تحتوي على أجار تريبتون من الأجار الصلب ، و قارورة مخروطية مملوءة بالقطن 250 مل فارغة يتم تعقيمها عند 121 درجة مئوية (15 رطل / بوصة مربعة) لمدة 15 دقيقة في الأوتوكلاف.

7. يسكب متوسط الأجار الصلب التريبتوني المعقم في الدورق المخروطي في 5 أطباق بتري معقمة ويسمح له بالتبريد ، للحصول على 5 لوحات آجار تريبتون الصلبة.

8. في قارورة مخروطية مخروطية مملوءة بالقطن سعة 250 مل ، 5 مل من مرق البكتيريا المعقم ، 5 مل من مستنبت E. coli B و 45 مل من مياه المجاري الخام يتم نقلها بشكل معقم ، ويفضل في غرفة التدفق الصفحي (الشكل 8.6) .

9. يتم تحضين القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، وذلك للسماح للمجففة في مياه الصرف الصحي بالتكاثر داخل الخلايا البكتيرية المضيفة (خلايا E. coli B).

10. يتم صب محتويات القارورة في أنابيب الطرد المركزي 100 مل ويتم طردها في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في جهاز للطرد المركزي لتهدئة الجسيمات. يتم التخلص من الرواسب.

11. يتم تصفيته طاف ، غنية في coliphage ، من خلال جهاز الترشيح الغشاء. يتم تجاهل بقايا.

12. تؤخذ خمسة أنابيب أجار لينة تريبتون معقمة وتسخن على حمام مائي إلى 100 درجة مئوية ، وذلك لإذابة الأجار. يتم تبريد الأنابيب والحفاظ عليها عند 45 درجة مئوية في حمام مائي.

13. باستخدام ماصة عقيمة ، 1 ، 2 ، 3 ، 4 و 5 قطرات من رشاحة خالية من البكتيريا ، يتم نقل غنية في coliphage جو مطهر إلى خمسة أجار تريبتوني لينة.

14. لكل أنبوب أغار لينة تريبتون ، يتم نقل 0.1 مل من ثقافة مرق المغذيات من الإشريكية القولونية B.

15- إن محتويات أشجار الآجار الناعمة الخمسة التريبتونية التي تحتوي على الفيروس والمبيضات والبكتيريا ، تختلط بسرعة E. coli B بتدوير الأنابيب بين راحتي اليدين.

16 - يتم صب المحتويات على ألواح أجار تريبتون الخمسة القوية (المرقمة من 1 إلى 5 قطرات) ، مما يشكل إعدادًا للثقافة مزدوجة الطبقة. يتم تحريك اللوحات بلطف وتسمح بتصلبها.

17. يتم تحضين الأطباق الملقحة في وضع مقلوب عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الحاضنة.