تجربة لزرع وتعداد البكتيريا
تجربة لتربية وتعداد البكتيريا!
المبدأ:
ويزرع معلق للبكتيريا ، عرضة لعدوى البكتريا (الفيروس الذي يصيب البكتيريا) مع هذا البكتيريا ، ويسمح للنمو كحشيقة متموجة على لوحة أجار.
تنمو جزيئات bacteriophage داخل خلايا البكتيريا وتطردها. ينتج عن تحلل خلايا البكتيريا تكوين مناطق واضحة في حديقة البكتيريا المتلاصقة. تسمى هذه المناطق الصافية "لويحات". يفترض أن تكون كل منطقة خالية من جسيمات بكتيرية واحدة. وبالتالي ، فإن عدد وحدات تشكيل اللويحات (PFUs) يمثل عدد البكتيريا.
يتم استخدام تقنية التخفيف التسلسلي في تعداد البكتيريا العصبية المشابهة لتلك المستخدمة في تعداد البكتيريا. يتم تحديد عدد جسيمات الملتهمة الموجودة في عينة من خلال حساب عدد اللوحات التي تشكلت على لوحة أجار المصنف وضرب هذا من قبل عامل التخفيف.
لتحديد عدد فجائي صالح ، يجب ألا يزيد عدد اللوحات في كل لوحة عن 300 ولا يقل عن 30. ويطلق على اللوحات التي تظهر أكثر من 300 PFUs "عددًا كبيرًا جدًا من العد" (TNTC) ، في حين يتم وصف لوحات تحتوي على أقل من 30 PFUs "عدد قليل جدا من العد" (TFTC).
المواد المطلوبة:
مرق تريبتون ، أجار تريبتون ناعم ، أجار تريبتوني صلب ، قارورة مخروطية ، أنابيب اختبار ، أطباق بتري معقمة ، مقابس قطنية ، ثقافة مخزونات بكتيرية (Ex: T 2 coliphage) ، ثقافة مرق المغذيات للبكتيريا (مثلا: Escherichia coli B) ، الماصات المعقم ، الأوتوكلاف ، حمام الماء الساخن ، الموقد bunsen ، غرفة تدفق الصفحي ، والتخلص جرة ، حاضنة.
إجراء:
1. يتم تعقيم خمسة عشر ماصة (في حالة ماصة الفولاذ المقاوم للصدأ) وخمسة أطباق بتري في فرن الهواء الساخن عند 180 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. أو بدلاً من ذلك ، يمكن تغطيتها بورق حرفي أو ربطها بخيط أو شريط مطاطي وتعقيمها في الأوتوكلاف مع الوسائط (الشكل 8.3).
2. يتم وزن مكونات محلول مرق التريبتوني أو مسحوقه الجاهز ، المطلوب من 100 مل من المرق في 100 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي سعة 250 مل بالاهتزاز والدوران. يتم تعديل درجة الحموضة إلى 7.5 باستخدام 0.1N HCI أو 0.1N هيدروكسيد الصوديوم كما هو مطلوب. يتم تسخين القارورة ، إذا لزم الأمر ، لإذابة المكونات تمامًا.
3. يتم توزيع المرق في 10 أنابيب اختبار (9 مل لكل منها) ، موصولة بالقطن ، مغطاة بورق حرفة ومربوطة بخيوط أو شريط مطاطي.
4. يوزن ويحلل مكونات 100 مل من الماء المقطر في قارورة مخروطية 250 مل عن طريق اهتزاز ودوران. يتم تعديل درجة الحموضة إلى 7.5 باستخدام 0.1N HCI أو 0.1N هيدروكسيد الصوديوم كما هو مطلوب. يتم تسخين القارورة لإذابة الأجار في الوسط بشكل كامل.
5. يتم توزيع هذه السائل في 5 أنابيب اختبار (2 مل لكل منهما) ، موصولة بالقطن ، مغطاة بورق حرفي ومربوطة بخيوط أو شريط مطاطي.
6. يتم وزن مكونات محلول آجار تريبتون الصلب أو مسحوقه الجاهز المطلوب لـ 100 مل من الوسط ويذوب في 100 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي سعة 250 مل بالتسخين بعد ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.5. القارورة موصولة بالقطن ومغطاة بورق حرفة ومربوطة بخيط أو شريط مطاطي.
7. يتم تعقيم 10 أنابيب مريب تريبتون ، 5 أنابيب أجار تريبتونية لينة والقارورة التي تحتوي على متوسط أجار تريبتون الصلب عند 121 درجة مئوية (ضغط 15 رطل / بوصة مربعة) لمدة 15 دقيقة في الأوتوكلاف.
8. تم سكب وسط الأجار الصلب التريبتون المعقم في الدورق المخروطي إلى 5 أطباق بتري معقمة لتعطير 5 أطباق أجار تريبتون.
9. يتم نقل واحد مل من ثقافة المخزون من bacteriophage (Ex: T 2 coliphage) بشكل معقم معقم ، ويفضل في غرفة تدفق الصفحي ، إلى أنبوب مريب تريبتوني (9 مل) باستخدام ماصة معقمة. هذا يصبح التخفيف 10 مرات (أي 10-1 ). يتم تخفيف هذا بطريقة معقمة بشكل متسلسل في أنابيب مرق تسعة أخرى ، وذلك للحصول على تخفيف نهائي من 10 -10 (الشكل 8.4).
10. يتم أخذ وتسخين 5 أنابيب أجار تريبتون لينة وتسخين على حمام مائي إلى 100 درجة مئوية ، وذلك لإذابة الأجار. يتم تبريد الأنابيب ويتم الحفاظ على الأنابيب الناعمة المنصهرة عند 45 درجة مئوية.
11- من بين الأنبوبين العشرة أعلاه المحتوية على البكتيريا بتركيزات مختلفة ، تم اختيار خمسة أنابيب (أي 10-5 ، 10 -6 ، 10 -7 ، 10 -8 و10-9 ). من هذه الأنابيب ، يتم نقل كل 1 ملطفي معقم 1 إلى أنابيب آجار تريبون الخمسة الناعمة باستخدام ماصات منفصلة معقمة.
12. يتم نقل قطرتين من ثقافة مرق المغذيات للبكتيريا (Ex: Escherichia coli B) بشكل معقم بشكل عقيم ، ويفضل في غرفة تدفق الصفحي ، لكل أنبوب أجار تريبتون ناعم يحتوي على البكتيريا في خمسة تركيزات مختلفة (10-5 إلى 10-9 ).
13- يتم خلط محتويات أنابيب الآجار الناعمة الخمسة التريبتونية المحتوية على البكتريا والعوامل البكتيرية بسرعة عن طريق الدوران بين راحة اليدين.
14. تم صب محتوياتها بشكل معقم من الناحية النظرية على لوحات آجار تريبتون الخمسة القوية المرقمة 10 -5 إلى 10 -9 ، وبالتالي تشكل إعداد ثقافة الطبق الطبقي المزدوج. يتم تحريك اللوحات بلطف وتسمح بتصلبها.
15. يتم تحضين اللوحات في وضع مقلوب عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
الملاحظات:
1. لوحظت جميع الصفائح لوحدات تشكيل البلاك (PFUs) التي تتطور كمناطق واضحة على مرج البكتريا.
2. فقط تلك اللوحات التي تحتوي على PFUs بين 30 و 300 تعتبر لعد العدوى. يتم احتساب عدد PFUs على كل لوحة. تم تعيين لوحات تظهر أكثر من 300 PFUs "عددًا كبيرًا للغاية من العد" (TNTC) ، في حين أن اللوحات التي تظهر أقل من 30 PFUs تم تصنيفها "أقل من أن تُحصى" (TFTC). مثل هذه اللوحات لا تعتبر.
3. استنادا إلى الملاحظات ، يتم حساب عدد bacteriophages لكل مل من ثقافة فج العقيمة باستخدام الصيغة التالية.
عدد البكتيريا / مل = رقم معامل التخفيف PFUs X
على سبيل المثال ، إذا كان عدد PFUs هو 280 في تخفيف من 10 -7 ، فإن عدد phage في ثقافة المخزون من phage هو 280 X 10 7 phage / ml (= 2.80 X 10 9 phage / ml).
