تكرار الحمض النووي: ملاحظات على تكرار الحمض النووي وإصلاح وإعادة التركيب

ملاحظات على تكرار الحمض النووي وإصلاح وإعادة التركيب!

تكرار الحمض النووي:

شبه الحمض النووي النسخ المتماثل:

تكرار الحمض النووي هو وظيفة autocatalytic من الحمض النووي. يحدث هذا عادة خلال المرحلة S من دورة الخلية عندما تكون الكروموسومات في شكل موسع للغاية. وكما اقترح واتسون وكريك ، فإن تكرار الحمض النووي شبه متحفظ.

في التكرار شبه المحافظ ، سوف ينفصل السدادين عن بعضهما البعض ، ويحافظان على سلامتهما وسيجمع كل منهما ، من مجموعة النوكليوتيدات ، حبلاها التكميلي. وستكون النتيجة ، أن الجزيء المركب حديثًا سيحمل أو يحافظ على أحد خيوطين من الجزيء الرئيسي وسيتم تجميع الحبلا الآخر حديثًا. هناك أدلة كافية لإثبات أن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل تتكرر حقا عن طريق أسلوب شبه المحافظ.

تجربة مسيلسون وستال (1958):

هؤلاء العمال مثقفون القولونية في وسط يحتوي على ¹⁵ ن نظائر. بعد أن تكررت هذه لبعض الأجيال في هذا الوسيطة كلا من خيوط هذا الحمض النووي تحتوي على ¹⁵ ن كمكون من البيورين و البيريميدين. عندما تم نقل هذه البكتيريا مع ¹⁵ N إلى وسط زراعي يحتوي على ¹⁴ N ، وجد أن الحمض النووي المنفصل عن الجيل الجديد من البكتيريا يمتلك خيطًا أثقل أثقل من الآخر.

يمثل الحبلا الثقيل حبلا الوالدين وأخف وزنا هو خيط جديد يتم توليفه من وسط المزرعة ، مما يشير إلى طريقة شبه محافظة لتكرار الحمض النووي واستبعاد كل من النماذج المحافظة والتشتت لتخليق الحمض النووي وتكراره.

لن ينتج تكرار المحافظين أي جزيئات DNA مع دستور "هجين". إذا كان التكرار مشتتًا ، لكان هناك تحول في الحمض النووي من "ثقيل نحو" الضوء عبر كل جيل.

وقد أثبتت الدراسات اللاحقة أن استنتاج ميسلسون وستال قد خلص إلى أن تكرار الحمض النووي شبه متحفظ ومدده إلى العديد من الكائنات الحية الأخرى ، بما في ذلك النباتات والحيوانات الأعلى.

تجربة كايرن للتصوير الإشعاعي:

كان يستخدم thymine المشعة أو tremiated thymidine. من خلال نمو E.coli في وسط مستنبت يحتوي على ثيميدين tritiated ، أدرج النشاط الإشعاعي في جزيئات DNA ابنه.

يُظهر جزيء الدنا المتكرر في الشريرة الذاتية شوكة مكررة ، وهي النقطة التي تصبح فيها السلاسل الأربعة من السلاسل. بعد التكرار الأول ، يُنظر إلى النشاط الإشعاعي في أحد خيوط الدنا فقط ، ووجد أن كلا الجدولين يحمل علامة بعد النسخ الثاني. هذا يدعم وسائط شبه المحافظ من تكرار الحمض النووي.

تؤكد تجارب JH Taylor على نصائح جذر Viciafaba (1957) أيضًا الطريقة شبه المحافظة لتكرار الحمض النووي.

أنا. تكرار الحمض النووي غير المتصل:

واقترح أوكازاكي أن يتم تخليق الحمض النووي في وقت واحد على كل من خيوط الحمض النووي باستخدام نفس إنزيم بوليميريز الدنا في شكل شظايا صغيرة معزولة. تُعرف هذه القطع بقطع أوكازاكي وتتكون من 1000-2000 نيوكليوتيد. وترتبط هذه معا عن طريق إنزيم بولينيوكليوتيد إنزيم ، واستكمال تشكيل سلسلة polynucleotide.

يتم دعم التركيب المتقطع للحمض النووي عن طريق تجربة التصوير الشعاعي الذاتي.

ثانيا. تكرار الحمض النووي أحادي الاتجاه وثنائي الاتجاه:

وخلصت J. Cairns من تجاربه إلى أن تخليق الحمض النووي يبدأ عند نقطة ثابتة على الكروموسومات ويتحرك في اتجاه واحد ، لكن التجارب الحديثة تشير إلى تكرار ثنائي الاتجاه.

اقترح Levinthal و Cairns أنه أثناء النسخ المتماثل ، لا يتم فصل السلاسل بالكامل قبل التكرار. وبدلاً من ذلك ، يبدأون في إلغاء الضغط في أحد نهايتيه ، وفي نفس الوقت تبدأ الشرائح غير المضغوطة بجذب أزواج النوكليوتيدات. وبهذه الطريقة ، يسير فك الضغط عن سواحل الحمض النووي الأصلية وتجميع خيوط الحمض النووي الجديدة جنبًا إلى جنب.

DNA polymerase:

بوليميراز الحمض النووي هو الإنزيم الرئيسي لتكرار الحمض النووي. تم إثبات نشاطه لأول مرة من قبل Kornberg في عام 1956. وهو يحفز إضافة تساهمية من deoxyribonucleotides إلى 3′-OH من النيوكليوتيد الموجود مسبقًا والذي يدعى التمهيدي.

يعتبر إنزيم بوليميراز -1 DNA الآن أنزيم إصلاح الحمض النووي بدلا من إنزيم التضاعف. من المعروف أن هذا الإنزيم يحتوي على خمسة مواقع نشطة ، وهي موقع القالب ، وموقع التمهيدي ، و 5 '-> 3 ′ موقع انقسام أو نوكلياز ، وموقع ثلاثي الفوسفات النوكليوسيدي ، و 3' -> 5 انقسام (أو 3 '-> 5 ′ نوكلياز في الموقع ).

DNA polymerase I:

وتشارك أساسا في إزالة الاشعال الحمض النووي الريبي من أوكازاكي أو شظايا السلائف وملء الثغرات الناتجة بسبب قدرتها على البلمرة 5 '-> 3'. إنزيم بوليميراز الحمض النووي I إنزيم يمكن أن يزيل أيضًا ثايمينات الثايمين الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية و سد الفجوة بسبب الاستئصال. وهذا ما يسمى إثبات قراءة أو تحرير وظيفة هذا الإنزيم.

DNA polymerase-II:

يشبه هذا الإنزيم بوليميريز-I في نشاطه ، ولكنه إنزيم إصلاح الحمض النووي ويحقق النمو في الاتجاه 5 '-> 3' ، باستخدام مجموعات 3 - OH مجاناً.

DNA polymerase-III:

يلعب دورا أساسيا في تكرار الحمض النووي. هو عبارة عن إنزيم متعدد الأنماط أو هولوإنزيم يحتوي على عشر وحدات فرعية مثل α و β و ε و θ و г و y وδ و δ و x و Ψ. كل هذه الوحدات الفرعية العشرة تحتاج إلى تكرار الحمض النووي في المختبر. ومع ذلك ، كل وجود وظائف مختلفة. على سبيل المثال ، لدى الوحدة الفرعية α 3 '-> 5 ′ تدقيق أو تحريض نسيجي خارجي. يتكون الإنزيم الأساسي من ثلاث وحدات فرعية ، β و θ. تبقي سبع وحدات فرعية زيادة في الإنتاجية (تعني العمليّة السرعة والكفاءة التي يمدّد بها بوليميراز الدنا سلسلة النمو).

دنا البلمرة DNA حقيقية النواة:

تم العثور على yukai yotes (على سبيل المثال ، الخميرة ، كبد الفئران ، خلايا الورم البشري) تحتوي على الأنواع الخمسة التالية من polymerases الحمض النووي:

(1) DNA polymerase α:

ويسمى هذا الإنزيم ذو الوزن الجزيئي المرتفع أيضًا بالبوليميراز السيتوبلازمي أو البلمرة الكبيرة. وجدت في كل من النواة والسيتوبلازم.

(ب) بوليميراز الدنا β:

ويسمى هذا الإنزيم أيضًا بالبوليميراز النووي أو بوليميراز صغير ، ولا يوجد إلا في الفقاريات.

(3) DNA polymerase y:

يسمى هذا الإنزيم بوليميريز الميتوكوندريا ويتم ترميزه في النواة.

(4) DNA polymerase δ:

تم العثور على هذا الإنزيم في خلايا الثدييات ، ويعتمد على PCNA في عملية توليف الحمض النووي (PCNA = مولد الخلايا النووية النووي المتكاثر).

(ت) بوليميراز الدنا ε:

كان يعرف سابقا باسم الحمض النووي بوليميريز 5II. هذا الإنزيم هو PCNA مستقل ويحدث في خلايا هيلا الثديية والخميرة في مهدها.

إن إنزيم بوليميراز الدنا الكبير هو إنزيم بوليمريز الدنا الغالب هو خلايا حقيقية النواة ، وكان يعتقد لفترة طويلة أن يكون الإنزيم الوحيد المتضمن في تكرار الحمض النووي. ولكن الآن هناك بوليمراز واحد آخر ، وبالتحديد بوليميريز الحمض النووي (8) ، والذي وجد أنه يشارك في مضاعفة الحمض النووي حقيقية النواة.

DNA Primers:

تحفز هذه الإنزيمات تخليق بدائل الحمض النووي الريبي (RNA) ، والتي تعد شرطا أساسيا لبدء تكاثر الحمض النووي في الغالبية العظمى من الكائنات الحية. قبل البدء الفعلي لتضاعف الحمض النووي ، يجب تركيب شرائح قصيرة من النوكليوتيد RNA ، يطلق عليها RNA primers أو ببساطة الاشعال ، بواسطة إنزيم برميز الحمض النووي الريبي باستخدام ريبوسوكسيوسيد ثلاثي الفوسفات.

يتم تصنيع هذا التمهيدي RNA عن طريق نسخ تسلسل أساسي معين من أحد خيط DNA ويختلف عن جزيء RNA نموذجي في ذلك بعد التركيب ، يبقى التمهيدي مرتبطًا بالهيدروجين مع قالب DNA.

الاشعال هو حوالي 10 النيوكليوتيدات طويلة في حقيقيات النوى ويتم إجراؤها على فترات على الحبل المتخلف حيث يتم إطالة من قبل أنزيم بوليميريز DNA لبدء كل جزء okazaki. يتم لاحقاً استبعاد هذه المواد الأولية من الحمض النووي الريبي (RNA) ومليئة بالحامض النووي (DNA) بمساعدة نظام إصلاح الحمض النووي في الكائنات المعزولة النواة.

في البكتيريا ، من المعروف أن اثنين من الانزيمات المختلفة لتوليف النيكلوكليوتيد RNA التمهيدي - بوليميراز الحمض النووي الريبي (على حبلا الرائدة) و primase الحمض النووي (على حبلا متخلفة).

بولينيوكليوتيد ليغاسي:

هذا الإنزيم هو إنزيم مهم سواء في تكرار الحمض النووي أو في إصلاح الحمض النووي. DNA ligase يحفز تكوين ارتباط فسفودايستي بين مجموعة 5′-phosphoryl من نوكليوتيد واحد ومجموعة 3-OH من الجار المباشر في جانب نيك في حبلا الحمض النووي. هكذا تغلق النكات في حبلا الحمض النووي.

نوكلياز داخلي:

كما أن نوكلينيات الإندونيكيون ، ولا سيما نوكليازات النوكليونات المقيدة ، مهمة أيضاً أثناء تكرار الحمض النووي وكذلك إصلاح الحمض النووي. أثناء تكرار الحمض النووي ، قد تنتج endounclease نيك في الأصل لبدء التكرار أو قد تحفز النكات لتوليد قطب لتسهيل إزالة الحمض النووي.

الانزيمات المشاركة في افتتاح DNA Helix:

DNA helicases:

طاردات الدنا هي عبارة عن إنزيمات الفك التي تعتمد على ATP والتي تعزز الفصل بين خيوط الوالدين وتؤسس شوكات التكرار التي سوف تتحرك تدريجيا بعيدا عن أصل المنشأ. يمكن تحفيز فك لولب دنا القالب عند شوكة التكرار من حيث المبدأ بواسطة طارقتين من الحمض النووي DNA ، تعملان في حفلة موسيقية ، واحدة تعمل على طول الشريط الرئيسي والأخرى على طول الخيط المتأخر.

خيط غير قابل للاستقرار (يطلق عليه أيضًا بروتين واحد ملزم ببروتين DNA أو SSBPs):

وراء شوكة النسخ المتماثل ، يتم منع خيوط الحمض النووي الفردي من إعادة لف بعضها البعض (أو تشكيل حلقات دبوس الشعر المزدوج تقطعت بهم السبل في كل حبلا) عن طريق عمل بروتينات SSB. ترتبط بروتينات SSB بشرائط الحمض النووي المكشوفة دون تغطية القواعد ، والتي ، بالتالي ، تبقى متاحة لعملية النمذجة.

Topoisomerases (DNA gyrases):

يقدم عمل helicase فائق السرعة الإيجابي في DNA مزدوج قبل شوكة النسخ المتماثل. الانزيمات ، وتسمى topoisomerases ، الاسترخاء في supercoil عن طريق ربط دوبلكس supercoil عابرة ، خدش واحد من فروع وتدويرها من خلال حبلا غير منقط. ثم يتم إغلاق نيك.

نوع واحد من topoisomerase (أي ، topoisomerase I) يؤدي إلى كسر حبلا واحد أو نيك الذي يسمح للفرعين من الحلزون DNA على جانبي النك لتدور بحرية بالنسبة لبعضها البعض ، وذلك باستخدام رابطة phosphodiester في حبلا مقابل النك كما نقطة قطب. النوع الثاني من توبويزوميراز (أي ، توبويزوميراز الثاني) يشكل رابطة رابطة تساهمية لكلا خيوط حلزون د ن أ في نفس الوقت ، مما يجعل كسر حبلا مزدوج الحلزون في الحلزون.

ريبليكون:

والنسخ المتماثل هو وحدة الحمض النووي (DNA) التي تحدث فيها عمليات التكرار الفردية ، أي أنها قادرة على تكرار الحمض النووي (DNA) بشكل مستقل عن أجزاء أخرى من الدنا. لذلك ، يحتوي كل النسخ المتماثل على أصل يبدأ منه النسخ المتماثل وقد يكون له نهاية حيث يتوقف النسخ المتماثل.

عادة ما تحتوي الكروموسومات البكتيرية والفيروسية على نسخة واحدة من كروموسوم / كروموسوم. على الرغم من وجود Phage T ، له أصلان ، أحدهما أساسي والآخر ثانوي ، ولكن في الأصل الأساسي ، يكون الأصل الثانوي ، كقاعدة ، غير وظيفي. في E. coli يتم تحديد نقطة المنشأ كموضع وراثي oriC.

يدعم أصل النواة بدائية كاملة الوظائف الثلاث التالية: (1) بدء التكاثر ، (2) التحكم في تكرار أحداث البدء و (3) فصل الكروموسومات المنسوخة في الخلايا البنت.

وقد تم تحديد الأصول في البكتيريا والخمائر والبلاستيدات الخضراء والميتوكوندريا. ميزة عامة هامة هي أنها A: T الغنية التي قد تكون مهمة لسهولة في فك أثناء النسخ المتماثل. يحتوي الأصل البكتيري على العديد من المواقع القصيرة (<10 bp) اللازمة لعملها. يتم فصل هذه المواقع في بعض الأحيان بمسافات محددة ولكن ليس بواسطة تسلسلات محددة. هناك حاجة إلى هذه المواقع تحديدا للربط من البروتينات المختلفة المشاركة في تكرار الحمض النووي.

العديد من النسخ المتماثلة بدائية النواة لها مواقع معينة ، تسمى terminus ، والتي توقف حركة شوكة النسخ المتماثل ، وبالتالي ، إنهاء تكرار الحمض النووي. يحتوي E. coli chromosome على اثنين من terminii ، يدعى T ₁ و T ₂ يقعان على بعد 100 كيلوبايت على جانبي النقطة التي يمكن أن تلتقي فيها الشوكات المكررة. كل محطة خاصة محددة لاتجاه واحد لحركة الشوكة.

يتم ترتيب T ₁ و T ₂ بطريقة تجعل كل شوكة يجب أن تمر الأخرى للوصول إلى النهاية المحددة لها. يتطلب إنهاء النسخ المتماثل نتاج الجين tus ، والذي ربما يرمز إلى بروتين يتعرف على T ، و T ₂ .

في حقيقيات النوى ، كل كروموسوم له عدة نسخ (مثل الخميرة ، 500 ؛ ذبابة الفاكهة ، 3،500 ؛ الفأر 25،000 ؛ Viciafaba ، 35،000). في أي مرحلة معينة خلال المرحلة S ، يخضع بعض هذه النسخ المتماثلة فقط للتكرار ؛ يبدو أن كل تكرار يتم تنشيطه في وقت محدد في تسلسل محدد. قد يختلف طول المربعات حقيقية النواة من 40 كيلوبايت في الخميرة وذبابة الدروسوفيلا إلى حوالي 300 كيلوبايت في فيكيا.

يبدو أن عدد النُسخ المتماثلة القابلة للكشف تتفاوت مع المرحلة التنموية ونوع الخلية أو النسيج. وهذا ما يفسر على أساس الأصول المحددة للأنسجة بحيث تنشط بعض الأصول في بعض الأنسجة ، بينما ينشط البعض الآخر في بعض الأنسجة الأخرى.

يتجلى ذلك من خلال ذبابة الفاكهة حيث تمتلك الخلايا الجنينية المبكرة عشرة أضعاف عدد النسخ المتماثلة لتلك الموجودة في الخلايا الجسدية البالغة. تشير الأدلة المتوفرة إلى أن النسخ المتماثلة حقيقية النواة لا تحتوي على terminii.

الإخلاص من النسخ المتماثل:

معدل الخطأ في تكرار الحمض النووي أقل بكثير من ذلك من النسخ بسبب الحاجة إلى الحفاظ على معنى الرسالة الجينية من جيل إلى جيل. على سبيل المثال ، معدل الطفرة التلقائية في E. coli هو حوالي خطأ واحد لكل 10 ¹⁰ قواعد مدمجة أثناء النسخ المتماثل.

ويرجع ذلك في المقام الأول إلى وجود الأشكال التوتومية البسيطة للقواعد التي غيرت خصائص الاقتران الأساسية. يتم تقليل معدل الخطأ من خلال مجموعة متنوعة من الآليات. سوف تدمج polymerases الحمض النووي فقط nucleotide واردة إذا تشكل الزوج الأساسي الصحيح مع النوكليوتيدات القالب في موقعه النشط.

يتم الكشف عن الخطأ العرضي من خلال 3 -> 5 ′ التدقيق النسيجي نوكلياز المرتبطة بالبوليميراز. هذا يزيل النوكليوتيدات غير الصحيحة من طرف 3′ قبل أي دمج آخر ، مما يسمح للبوليميريز بعد ذلك بإدخال القاعدة الصحيحة. لكي تعمل دواء نوكليازات النسخ العقيدة بشكل صحيح ، يجب أن تكون قادرة على تمييز زوج أساسي صحيح من زوج غير صحيح.

إن الحركة المتزايدة للأزواج القاعدية "غير المرتبطين" عند 5 very نهاية الشظايا المتراكمة حديثًا من الحمض النووي تعني أنه لا يمكن أبدًا أن تظهر بشكل صحيح وبالتالي لا يمكن تدقيقها. ومن ثم ، فإن النيوكليوتيدات القليلة الأولى هي ريبونوكليوتيدات (RNA) بحيث يمكن تحديدها لاحقًا على أنها مادة منخفضة الدقة واستبدالها بحمض DNA ممدود (ومدقق) من الجزء المجاور. يتم تصحيح الأخطاء التي تهرب من التدقيق عن طريق آلية إصلاح عدم التطابق.

آلية تكرار الحمض النووي في بدائيات النوى:

تمت دراسة تكاثر الحمض النووي في المختبر على نطاق واسع في E.coli وفي phages وال plلازميدات في E. coli. في E. coli ، تتضمن عملية تكرار الحمض النووي الخطوات الثلاث الرئيسية التالية:

1. بدء تكرار الحمض النووي:

تتألف هذه العملية من ثلاث خطوات: (1) التعرف على الأصل (O) ، (2) فتح دوبلكس الدنا لإنشاء منطقة من الحمض النووي الأحادي الجديلة ، و (3) التقاط بروتين Dna B (أي 5 - 3 ′ helicase ؛ كما يعمل منشط primase). وهكذا ، يربط معقد Dna-A (أو البروتين البادئ) ATP في مناطق تكرار 9 مقلوبة (R ، R ، R _v R ₄ ) من ori C من E. coli ويعزز فتح دوبلكس الحمض النووي في منطقة مكونة من ثلاثة تكرار مباشر لتسلسل 13-bp (يسمى 13-mers).

يحدث الفتح من اليمين 13 ميرًا إلى اليسار ويتطلب بروتوكولات DNA DNA و HU أو IHF البادئ بشكل سلبي. يتم نقل Dna B (-hicase) إلى الحمض النووي الفردي المحصور ويتسبب في إزالة الحمض النووي في وجود A TP وبروتين SSB و gyrase الحمض النووي (topoisomerase).

وينتج عن ذلك تفكيك الحمض النووي دوبلكس والتكرار من عائدات ori C في كلا الاتجاهين (ثنائي الاتجاه) ؛ يحدث ربط SSB في مناطق فردية تقطعت بها السلاسل ، ويتم تحميل مجمعين Dna B (= البراموسومات) واحدًا على كل حبلا.

2. استطالة سلسلة الحمض النووي:

تتطلب هذه الخطوة وجود الإنزيمات والعوامل التالية: 1. Dna B أو helicase (وتسمى أيضًا مُحفِّز الهاتف المحمول) ؛ 2. primase (دنا جي) ؛ 3. DNA البلمرة holoenzyme (أو DNA III III) ؛ 4. بروتين SSB 5. RNAase H الذي يزيل الاشعال الحمض النووي الريبي. 6. بوليميراز الحمض النووي I الذي يستخدم لملء الفجوة التي تم إنشاؤها بسبب برايمر الحمض النووي الريبي و 7. ligase الحمض النووي (الذي يحول شظايا okazaki primerless إلى حبلا المستمر). أثناء البدء إلى الانتقال استطالة ، تحدث الأحداث التالية:

(ط) بينما ينتقل helicase (أو Dna B) في اتجاه 5 ′ - 3، ، فإنه ينشئ شوكة تكرار عن طريق فتح دوبلكس DNA.

(2) يصبح حبل الحمض النووي الذي يحتوي على helicase الحبل المتخلف. ويرتبط الحمض النووي الريبي (DNA) مع دنا (B) helicase ، ويكوّن البزموسوم (primosome) الذي يقوم بتركيب العديد من البادئات (primers) للتأخر المتعرج ، والراسم التمهيدي وحيد الرنا (RNA) للفرع الرئيسي.

(3) لتوليف الخيط المتأخر ، يجب أن يعمل سلالة DNA III HE على نفس الحافة التي ترتبط بها الديدان الحلزونية Dna B ، ولكنها تنتقل في الاتجاه المعاكس.

(iii) DnaB helicase و Dna Gprimase و DNA pol III FIE يعملان معاً في الاستطالة. تبقى تركيبة الهليكسيز والحمض النووي للبوليميراز عملية ، بمعنى أنها تظل ملتزمة بقوة بالشوكة وتظل مقيدة طوال التفاعل.

يحدث التجميع (- الاستطالة) للخيوط المتدحرجة والرائدة بواسطة طرق مختلفة إلى حد ما ؛ إنه أكثر تعقيدًا بكثير بالنسبة للخيوط المتخلفة أكثر من الحزام الرئيسي:

(أ) توليف متقطع على حبلا متخلفة:

1. بريماز يتم أخذها من المحلول ويتم تفعيلها من قبل helicase (DnaB) لتكوين التمهيدي الرنا (10 إلى 20 nt أو nucleotides) على الحبل المتخلف.

2. تم التعرف على برايمر الحمض النووي الريبي من قبل سلالة DNA III HE على الحافة المتأخرة ويتم استخدامها لتخليق السلائف أو أجزاء أوكازاكي. في الواقع ، يتم التعرف على كل برايمر RNA جديد من قبل وحدة جاما (y) من سلالة DNA III HE وتحميلها بوحدة p من نفس بوليميراز. قد تقوم هذه الوحيدات p مسبقة التحميل بالتقاط جوهر DNA poly III HE عندما تصبح متوفرة بعد الانتهاء من وظيفتها التركيبية على جزء okazaki السابق.

3. عند اكتمال شظايا أوكازاكي ، يتم استئصال برايمر الحمض النووي الريبي بواسطة بوليميراز الدنا 1 ، الذي يملأ الفراغات الناتجة مع الحمض النووي.

4. بعد إضافة بوليميراز الحمض النووي ، أقوم بإضافة النقص الأخير من ديوكسي ريبونوكليوتيد في الفجوة التي تركها التمهيدي المستأصل ، فإن إنزيم الحمض النووي (DNA ligase) يربط رابطة فسفوديستر التي تربط بين 3 free نهاية بديل التمهيدي و 5 of نهاية جزء أوكازاكي.

(ب) التوليف المستمر على حبلا الرائدة:

1. في مضاعفة الحمض النووي ثنائية الاتجاه ، يتم تحريك الحبلا الرائد مرة واحدة في كل من خيوط الوالدين.

2. يتم تحضير برايمر RNA من الحبلا الرائد بواسطة إنزيم polymerase RNA.

3. DNA pol III HE يسبب استطالة الخيط الرائد وأخيرًا DNA pol 1 و ligase enzymes تعطي اللمسة الأخيرة للخط الرئيسي كما في حالة الخيط المتأخر.

تكرار الحمض النووي في الكائنات المعزولة النواة :

يتطلب مضاعف الحمض النووي حقيقي النواة أنزيمين مختلفين من بوليميريز الحمض النووي ، وهما دنا بوليميريز DNA و polymerase δ. يخلط DNA polymerase الحمض النووي على الخيط الرئيسي (تخليق الدنا المستمر) ، في حين يقوم دنا البلمرة DNA بتوليف الحمض النووي على الخيط المتأخر (توليف الدنا المتقطع). إلى جانب هذين الإنزيمين ، تكرار الحمض النووي: (1) T مستضد ؛ (2) عامل النسخ المتماثل A أو RF-A (ويسمى أيضًا RP-A أو حقيقته الذاتية حقيقية النواة) ؛ (3) توبويزوميراز الأول ؛ (4) توبويزوميراز الثاني ؛ (5) تكاثر - مستضد الخلايا النووية (PCNA ، وتسمى أيضا cyclin) ، و (6) عامل التكرار Corf-C.

تتضمن عملية مضاعفة الحمض النووي حقيقية النواة الخطوات التالية:

1. قبل بداية تخليق الحمض النووي ، هناك مرحلة ما قبل التخدير تتراوح مدتها بين 8-10 دقائق لتشكيل معقد الحمض النووي الراسخ. تحتاج هذه الخطوة إلى ثلاثة بروتينات مُنقى فقط ، أي T المستضد (T-ag أو مستضد الورم) ، RF-A و topiosomerases I و II.

2. إن مستضد T ، باستخدام مجال ربط DNA الخاص به ، يشكل مركب متعدد الوحدات مع الموقع I والموقع II في وجود A TP وتسبب في الفك المحلي.

3. أكثر الفك دوبلكس واسعة النطاق يحدث بسبب ارتباط بين RF-A و topoisomerase مع - مساعدة مكون DNA helicase من T-ago Topoisomerases تساعد في إزالة الحمض النووي عن طريق تغيير طوبولوجيا الحمض النووي في شوكة التكرار.

4. بروتينات RF-A أو SSB ترتبط بتفكيك الحمض النووي المنفصل.

5. يتم تنفيذ توليف RNA التمهيدي من قبل primase الذي يرتبط بإحكام مع DNA بوليميريز السابقين.

6. بوليميراز الحمض النووي يساعد في تركيب جزء okazaki في 5 ′ إلى 3 ′ الاتجاه.

7. يساعد عامل النسخ التكراري C (أو RF-C) و PCNA (cyclin) في تبديل polymerases الحمض النووي بحيث يتم استبدال pol أ بول 5 التي ثم تجميعها باستمرار الحمض النووي على حبلا الرائدة.

8. ثم يتم تجميع جزء آخر من أوكازاكي من شوكة التكرار على خيط متخلف من قبل مجمع أ - معقد البادئ وتكرار هذه الخطوة مراراً وتكراراً ، حتى يتم تغطية جزيء الحمض النووي بأكمله.

9. تتم إزالة الاشعال RNA ويتم ملء الفجوات كما في تكرار الحمض النووي prokaryotic.

في الآونة الأخيرة ، تم التأكيد على دور DNA polymerase e في تكرار الحمض النووي DNA ، بحيث أن ثلاثة من polymerases الحمض النووي (a ، δ و ε) معروفة الآن بأنها تشارك في مضاعفة الحمض النووي حقيقية النواة. اقترح سوغينو وزملاؤه أن بوليميراز الحمض النووي (أ) يمكن أن يعمل في كل من الخيوط الرائدة والمتخلفة (حيث أن البلمرة أ لديه نشاط أساسى ألفا) ، في حين أن polymerase e و polymerase 5 متورطين في إستطالة الأعمدة الرئيسية و المتخلفة على التوالي.

آلية تدمير وإصلاح الحمض النووي

أنواع أضرار الحمض النووي:

1. الآفات الحمض النووي:

ويسمى أي تغيير في التركيب الطبيعي الكيميائي أو الفيزيائي للحمض النووي باسم آفات الحمض النووي. يمكن للعديد من العوامل الخارجية ، مثل المواد الكيميائية والإشعاعية ، أن تحدث تغيرات في مواقع ذرات النيتروجين والكربون في الأنظمة الحلقية غير المتجانسة في القواعد وبعض المجموعات الوظيفية الحلقية (أي الكيتو والمجموعات الأمينية في القواعد).

وقد يؤدي ذلك إلى فقدان الاقتران الأساسي أو تعديل الاقتران الأساسي (على سبيل المثال ، يمكن أن يتغير A المعدل مع زوج C بدلاً من T). إذا سمح لهذه الآفة بالبقاء في الحمض النووي ، يمكن أن تصبح طفرة ثابتة في الحمض النووي عن طريق الطفرات المباشرة أو غير المباشرة.

وبدلاً من ذلك ، قد ينتج التغيير الكيميائي تشوهًا ماديًا في الـ DNA الذي يمنع التكرار و / أو النسخ ، مما يؤدي إلى موت الخلية. وهكذا ، فإن آفات الحمض النووي قد تكون مطفرة و / أو قاتلة. بعض الآفات تلقائية وتحدث بسبب التفاعل الكيميائي المتأصل للحمض النووي ووجود أنواع كيميائية طبيعية تفاعلية داخل الخلية.

على سبيل المثال ، يخضع السيتوزين الأساسي إلى عملية إضمحلال تلقائي هيدروليكي لإعطاء اليوراسيل. إذا تركت اليوراسيل بدون إصلاح ، فسوف تشكل زوجًا أساسيًا مع الأدينين أثناء التكرار التالي ، مما يؤدي إلى طفرة نقطية. ويمثل التضيق رد فعل تحليلي تلقائي آخر يتضمن انشقاق رابطة N-glycosylic بين N-9 لقواعد البيورين A و G و C-l 'لسكر الديوكسيريبوز وفقدان قواعد البيورين من الحمض النووي. يظل العمود الفقري للسكر - الفوسفات سليماً. موقع apurinic الناتج هو آفة غير مشفرة ، حيث يتم فقدان المعلومات المشفرة في قواعد البيورين.

2. الأضرار التأكسدية:

يحدث هذا في ظل الظروف الطبيعية بسبب وجود أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في جميع الخلايا الهوائية ، على سبيل المثال superoxide ، بيروكسيد الهيدروجين ، والأهم من ذلك ، جذور الهيدروكسيل (OH). يمكن لهذا الراديكالي أن يهاجم الحمض النووي ، أنا في عدد من النقاط ، ننتج مجموعة من منتجات الأكسدة ذات الخصائص II المعدلة ، على سبيل المثال 8-oxoguanine ، 2-oxoadenine و 5-formyluracil. يمكن زيادة مستويات هذه من خلال جذور الهيدروكسيل من إشعاع الماء الذي يسببه الإشعاع المؤين.

3. ألكلة:

إن عوامل الألكلة هي مواد كيميائية حساسة للكهرباء تضيف بسهولة مجموعات الألكيل (مثل الميثيل) إلى مواقع مختلفة على أحماض نووية متميزة عن تلك التي ميثليتها بواسطة إنزيمات الميثيل الطبيعية. الأمثلة الشائعة هي سلفونات الميثيل ميثان (MMS) و ethylnitrosourea (ENU).

الأمثلة النموذجية للقواعد الميثيلية هي 7 ميثيل غوانين ، 3-ميثيل-أدينين ، 3- ميثيل غوانين و 0-ميثيل جوانين. بعض هذه الآفات قد تكون قاتلة لأنها يمكن أن تتداخل مع إزالة الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل والنسخ. معظمها مطفرة بشكل غير مباشر. ومع ذلك ، 0 -methylguanine هو آفة مطفرة مباشرة لأنها يمكن أن تقرن مع الثايمين خلال التكرار.

4. ملتوية الضخمة:

تتشكل ثنائيات سيكلوبوتان بيريميدين عن طريق الأشعة فوق البنفسجية من البيريميدينين المجاور على خيط واحد عن طريق إخماد ذرات الكربون C5 و C6 ثنائية القاعدة لكل قاعدة لإعطاء حلقة سيكلوبوتين. يؤدي فقدان قاعدة الاقتران مع الخلاف المعاكس إلى تمسخ موضعي للحمض النووي الذي ينتج آفة ضخمة من شأنها تعطيل النسخ والتكرار. نوع آخر من ديميريدين ديمر ، 6 ، 4-فوتوبروتك ، ينتج عن تكوين رابطة بين C6 لقاعدة بيريميدين و C4 للقاعدة المجاورة.

عندما يتم استقلاب البنزران القطران الفحم [a] بيرين عن طريق السيتوكروم P-450 في الكبد واحد من نواتج الأيض (أي ديوكسيد ديول) يمكن أن يربط تساهمية إلى مجموعة الأمينو 2 من بقايا الجوانين. العديد من عوامل arylating aromatic أخرى من adducts تساهمية مع الحمض النووي. سرطان الكبد الأفلاتوكسين B ، يرتبط أيضا التساهمية إلى الحمض النووي.

إصلاح الحمض النووي:

تتعرف أنظمة الإصلاح على مجموعة متنوعة من التغييرات في الحمض النووي لبدء الإجراء. قد تحتوي الخلية على عدة أنظمة للتعامل مع تلف الحمض النووي. وتشمل هذه الأنظمة ما يلي: (1) الإصلاح المباشر ، (2) إصلاح الختان (3) إصلاح عدم التوافق ، (4) أنظمة متسامح و (5) أنظمة استرجاع.

1. إصلاح المباشر:

ويعرف العكس أو الإزالة البسيطة للضرر الذي أصاب الحمض النووي بالاصلاح المباشر ، على سبيل المثال ، إزالة الروابط التساهمية بين الكاربون 4 و 5 5 من بقايا الثايمين التي تشارك في تشكيل ثايمينات الثايمين.

وتتكون عموميات الثايمين بشكل عام بسبب الأشعة فوق البنفسجية وتتداخل مع النسخ والتكرار. لاحظ كيلنر (1949) أن عددًا كبيرًا من البكتيريا يمكن أن ينجو من جرعات كبيرة من الأشعة فوق البنفسجية. إذا تعرضوا لمصدر مكثف للضوء المرئي.

وتسمى هذه الظاهرة بالتمثيل الضوئي. وقد تبين فيما بعد أنه أثناء التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية يرتبط إنزيم معين بشكل انتقائي بالحامض النووي البكتيري. أثناء عملية تنشيط الفوتون ، يتم تنشيط الإنزيم بواسطة الضوء المرئي. يشطر dimers الثايمين ، وبالتالي استعادتها إلى شكلها الأصلي. عملية الإصلاح هذه هي إنزيم بوساطة وتعتمد على الضوء.

2. إصلاح الختان:

في آلية الإصلاح هذه ، يتم استئصال الجزء التالف أو المحوّل من خيط DNA ويتم تصنيع رقعة جديدة من DNA في مكانها. على الرغم من اختلاف أنظمة إصلاح الختان في خصوصيتها ، إلا أن المسار الرئيسي يتضمن الخطوات الثلاث التالية:

(ط) الاعتراف والشق:

يتم التعرف على الجزء التالف / المحرف من حبلا الحمض النووي بواسطة نوكلياز داخلي ؛ هذا الانزيم ثم يقطع حبلا المتضررة على جانبي الضرر.

(ثانيا) الختان:

A 5 ′ -> 3 ′ exonuclease (DNA polymerase I) يستبعد الجزء التالف / المحرف؛ هذا يولد منطقة واحدة تقطعت بها السبل في الحلزون المزدوج DNA.

(3) التجميع:

في هذه الخطوة ، تخدم المنطقة التي تقطعت بها السلاسل المفردة الناتجة عن الاستئصال كنموذج لبوليميراز الدنا الذي يولد الاستبدال للقطعة المستأجرة. DNA ligase ثم ختم النيك الذي يبقى بعد تركيب بديل للقسم المستأصل.

في E. coli ، يكون الاستئصال على الأرجح بسبب نشاط 3 ′ -> 5 ′ نوكلياز من DNA polymerase I ، بينما يتم إنجاز التوليف بواسطة نشاط 5 ′ -> 3 ′ polymerase لنفس الإنزيم. إن أنظمة إصلاح الختان شائعة جدا في كل من بدائيات النواة وحقيقة النواة. وتعرف بعض هذه الأنظمة الضرر العام للحامض النووي ، في حين أن بعضها الآخر يكون محددًا للغاية ، على سبيل المثال ، تقوم نواقل end endusucleases بإزالة بقايا الريبوز من مواقع التصريف. إصلاح الختان ينطوي على أطوال مختلفة من الحمض النووي ويتم تجميعها في الفئات الثلاث التالية:

(أ) الإصلاح القصير جداً (VSP):

يتعامل هذا النظام مع إصلاح عدم التطابق بين قواعد محددة.

(ب) إصلاح قصير للقطعة:

في هذا النظام حوالي 20 قاعدة يتم استئصال الحمض النووي طويلة ، ويتم إصلاح الأضرار من خلال الجينات uvr (الأشعة فوق البنفسجية ، A ، B ، C ، من E.coli) ، الترميز لمكونات endonuclease الإصلاح. وهناك حاجة أيضا إلى أنزيم uvr D آخر لنشاط helicase.

(ج) إصلاح البقعة الطويلة:

ينطوي هذا النظام على استئصال حوالي 1500 قاعدة طويلة ، ولكن في بعض الأحيان قد يكون الجزء المستأصل أكثر من 9000 قاعدة. وهو أقل شيوعًا ويجب تحريضه عن طريق التلف الذي يمنع التكرار. في E. coli يتضمن هذا النظام أيضًا جينات uvr و DNA polymerase I.

3. عدم تطابق إصلاح:

إنه ينطوي على تصحيح عدم التطابق أو الإقران بين القواعد التي لا تكمل. قد ينشأ عدم التطابق إما (أ) أثناء التكرار أو (ب) بسبب تغيرات الأساس (على سبيل المثال ، نزع السيتوزين إلى اليوراسيل) وينتج عنه تشوهات هيكلية في الحلزون المزدوج للحمض النووي. يتم التعامل مع هذه البدائل في E. coli بواسطة نظام إصلاح الخدوش القصير جداً الموضح أدناه.

نظام إصلاح عدم التطابق في E. coli:

عندما يكون هناك عدم تطابق في زوج أساسي كما هو الحال في GC -> GT ، فمن الناحية النظرية قد يتم إصلاحه ليؤدي إلى إما النوع البري (GC) أو إلى نوع متحولة (AT). ولذلك ، فإن نظام الإصلاح يجب أن يميز بين الجدائل القديمة والجديدة ويصلح فقط الجدائل الجديدة لاستعادة النوع البري.

يتم ذلك عن طريق نظام إصلاح الاستئصال ذي التصحيح القصير جداً ويتطلب أربعة بروتينات هي: Mut L ، و Mut S ، و Mut U ، و Mut mut في E. coli على التوالي بواسطة الجينات Mut L ، و mut S ، و mut U و mut H.. يتم إنتاجها أثناء النسخ المتماثل بواسطة نظام إصلاح السد.

ينتج السد الجيني لـ E. coli ميثيليز ميثيليتين adenine من تسلسل GATC على كلا خيوط الدنا. ينتج عن استنساخ تسلسل GATC الكامل الميثيلي تسلسل هيميميثيلي حيث تكون البقايا A في الخيوط المركَّبة حديثًا غير ميثليته.

يتم استخدام الحالة غير الميثانية من هذا التسلسل الهدف لتحديد حبلا جديد ؛ يتم استئصال القواعد حول موقع عدم تطابق في حبلا جديدة ويتم توليف بديل. يتضمن النظام منتجات من الجينات L و mut و mut و UVr D.

إصلاح أنظمة الاسترجاع:

تُعرف هذه الأنظمة أيضًا باسم "إصلاح ما بعد النسخ المتماثل" أو "إصلاح إعادة التركيب". في E.coli ، يقوم نظام الإصلاح هذا على الجين A Rec الذي ينتج بروتين Rec A. Rec وظيفة البروتين في تبادل الخيوط بين جزيئات الحمض النووي خلال إعادة التركيب الوراثي ، كما تعمل في تبادل الأحادية أثناء إعادة التركيب. يبدو أن هناك اثنين من المسارات A ، واحدة تنطوي على جينات Rec B و C والأخرى تنطوي على rec F.

يعمل نظام الإصلاح هذا عندما يمنع تشوه بنيوي النسخ المتماثل في الموقع المتضرر. على سبيل المثال ، لن تتمكن E. coli mutants القاصرة في إصلاح الختان من إزالة ثايمينات الثايمين. في مثل هذه الحالة ، يستمر النسخ المتماثل عادةً تصل إلى المواقع التالفة؛ يوقف polymerase الحمض النووي تكرار الخندق المتأثر ويجدد النسخ المتماثل تخطي الماضي الموقع التالف.

يتم تكرار الحبلا التكميلي بشكل طبيعي في الموقع المتضرر في الخيط الآخر. لذا ، فإن التكاثر يؤدي إلى سلالة واحدة عادية من جزيء الحمض النووي وجزيء واحد له ثنائيات الثايمين في جديلة واحدة وفجوة طويلة في حبلاه التكميلي. سيتم فقدان جزيء الدنا مع الدايت الثايمين ما لم يتم إصلاحه عن طريق سد الفجوة في أحد فروعه.

يتحقق ذلك عن طريق التبادل الأحادي بين جزيئتي ذرية الدنا. منطقة التبادل تملأ الفجوة ويتم إحداثها بواسطة البروتين Rec A. وكنتيجة لهذا التبادل ، فإن جزيء النسل الطبيعي له منطقة أحادية الجديلة بها فجوة. يتم إصلاح هذه الفجوة عن طريق توليف الحمض النووي.

نظام التسامح:

تتعامل هذه الأنظمة مع الأضرار التي تمنع التكرار الطبيعي في الموقع المتضرر ربما عن طريق السماح بتكرار المواقع التالفة مع تكرار أخطاء عالية. قد تكون هذه الأنظمة مهمة بشكل خاص في حقيقيات النوى حيث يكون حجم الجينوم كبيرًا جدًا ومن ثم فإن الإصلاح الكامل للضرر ليس بالأمر المحتمل.