تهدف إلى عزل البكتيريا المختلفة الحالية في عينة معينة والحفاظ على الثقافات النقية

تهدف إلى عزل البكتيريا المختلفة الموجودة في عينة معينة والحفاظ على ثقافاتهم نقية.

غرض:

البكتيريا الموجودة في الطبيعة ، لا تحدث كأنواع منفصلة ، بل تحدث كمجموعات مختلطة من أنواع مختلفة.

لذلك ، لدراسة الأنواع الفردية من البكتيريا ، فإنه مطلوب أولاً فصلها عن السكان المختلطين. هذه العملية تسمى "عزل البكتيريا".

يتم تحقيقه عن طريق زراعة مجموعة مختلطة من البكتيريا على سطح وسيط صلب في مستعمرات منفصلة. "المستعمرات" هي كتل مرئية وعلمية من البكتيريا التي تنمو على سطح الوسط الصلب ، كل منها يمثل مضاعفة البكتيريا المفردة.

وبما أن كل مستعمرة تأتي من النمو والتكاثر المتكرر لبكتيريا واحدة ، فإن جميع البكتيريا الموجودة في المستعمرة تنتمي إلى نفس النوع. وهكذا ، تمثل كل مستعمرة مجموعة كبيرة جدًا من نوع واحد من البكتيريا.

يتم نقل هذه المستعمرات بطريقة معقمه لفصل آغار المغذيات الغذائية ويسمح للنمو هناك. يُطلق على الأنواع المعزولة من البكتيريا ، التي تُزرع بشكل منفصل على مبيدات الآغار ، "الثقافات النقية". في كل 15 إلى 30 يومًا ، يتم نقلها إلى مبيدات طازجة ، بحيث لا تفقد خصائصها الأصلية بسبب الازدحام الشديد ونقص العناصر الغذائية وتراكم المستقلبات.

بهذه الطريقة ، يتم الحفاظ على ثقافات البكتريا النقية في المختبر من خلال نقلها بشكل متكرر إلى الماعز الطازج على فترات منتظمة. تُعرف هذه العملية بـ "صيانة الثقافة النقية". يتم الحفاظ على الثقافات النقية في المختبر لتحديدها لاحقا من خلال تقنيات مختلفة ، وتلطيخ البيوكيميائية ، المصلية والجزيئية وكذلك لاستخدامها في المستقبل.

"ثقافات الأوراق المالية" هي عبارة عن ثقافات نقية قياسية ، تم تحديد هويتها دوليًا للجنس أو الأنواع أو الأنواع الفرعية أو النوع أو النوع الفرعي. يتم الاحتفاظ بها في مختبرات الميكروبيولوجيا المعترف بها دوليا.

يمكن للمختبرات الأخرى الحصول عليها من هذه المختبرات والمحافظة عليها في مختبراتها الخاصة كمزارع ثرائها ، من خلال النقل المتكرر إلى الماعز الطازج على فترات منتظمة. يتم استخدامها لتحديد هوية الثقافات النقية التي تم الحصول عليها في هذه المختبرات من خلال مقارنة خصائصها مع تلك الخاصة بثقافات الأسهم القياسية.

المبدأ:

تزرع المجموعة المختلطة من البكتيريا الموجودة في مادة معينة (صلبة أو سائلة أو سطحية) على صفائح أجار المغذيات عن طريق لوحة الصفيحة أو طريقة اللوح المتسلسل كما هو موضح سابقًا تحت عنوان "زراعة البكتيريا". كل مستعمرة معزولة تم العثور عليها على صفيحة أجار تتكون من نوع واحد من البكتيريا ، حيث تنمو كل مستعمرة من بكتيريا واحدة.

وهكذا ، يتم عزل البكتيريا على لوحات أجار بتقنيتين على النحو التالي:

(أ) تقنية لوحة الانتشار

(ب) تقنية لوحة الانتصارات

يتم اختيار المستعمرات التمثيلية (المستعمرات ذات الخصائص غير المتشابهة) ويتم تلقيحها بشكل مطبوخ لفصل ذرات آغار للحصول على الثقافات النقية. بعد كل 15 إلى 30 يومًا ، يتم نقلها إلى مبيدات طازجة للحفاظ على هذه الثقافات النقية.

المواد المطلوبة:

أنابيب الاختبار (5 عدد.) ، قارورة مخروطية 250 مل (1 لا) ، 0.1N هيدروكسيد الصوديوم ، 0.1N HCI ، الماء المقطر ، أجار المغذيات ، القطن غير الماصة ، حلقة ، ورق الحرف ، الخيط (أو الشريط المطاطي) ، ورقة الأس الهيدروجيني (أو مقياس درجة الحموضة) ، الموقد الأوتوكلاف ، الأوتوكلاف ، غرفة تدفق الصفحي ، حاضنة ، لوحات تحتوي على مستعمرات معزولة من البكتيريا (لوحة انتشار أو لوحة streak).

إجراء:

1. يتم وزن مكونات محلول آجار المغذيات أو مسحوقها الجاهز المطلوب لـ 100 مل من الوسط ويذوب في 100 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي سعة 250 مل بالاهتزاز والدوران (الشكل 6.4).

2. يتم تحديد درجة الحموضة باستخدام ورقة الرقم الهيدروجيني أو مقياس الرقم الهيدروجيني وتعديلها إلى 7.0 باستخدام 0.1N HC1 إذا كان أكثر أو استخدام 0.1N هيدروكسيد الصوديوم إذا كان أقل.

3. يسخن القارورة لتذويب الأجار في الوسط بشكل كامل.

4. قبل أن تصلب ، يتم توزيع المتوسط ​​في حالة منصهرة دافئة في 5 أنابيب اختبار (حوالي 20 مل لكل منهما).

5. أنابيب الاختبار موصولة بالقطن ، مغطاة بورق حرفي ومربوطة بخيط أو شريط مطاطي.

6. يتم تعقيمها عند 121 درجة مئوية (ضغط 15 رطل / بوصة مربعة) لمدة 15 دقيقة في الأوتوكلاف.

7. بعد التعقيم ، يتم إزالتها من الأوتوكلاف ويتم الاحتفاظ بها في وضع مائل لتبريد وترسيخ الوسط. وتسمى أنابيب الاختبار هذه التي تحتوي على وسط أجار مغذي متصلب في حالة مائلة "مبيدات أغار المغذيات".

.8 ﻳﺠﺐ إﺟﺮاء اﻟﺨﻄﻮﺗﻴﻦ 10 11 و ﺑﻌﺪ إﺟﺮاء ﺗﻘﻨﻴﺔ ﺗﻌﻘﻴﻢ وﻳﻔﻀﻞ ﻓﻲ ﻏﺮﻓﺔ ﺗﺪﻓﻖ ﺻﻔﺎﺋﺢ. يجب أن يظهر فم الحاويات التي تحتوي على وسائط أو ثقافات معقمة على لهب الموقد بنزين بعد إزالة القابس القطن وقبل إعادته.

الحلقات ، قبل الاستخدام يجب تعقيمها على اللهب بالتسخين إلى الأحمر الساخن ثم التبريد لمدة 30 ثانية لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. لا ينبغي أبدا استخدامها عندما تكون ساخنة جدا ، لأنها تقتل الميكروبات عند لمسها.

9. في التجربة السابقة ، إذا كان من الممكن ملاحظة المستعمرات المعزولة على لوحة الانتشار أو لوحة الإنتزاع ، يتم اختيار خمس مستعمرات ذات خصائص مختلفة كمستعمرات تمثيلية.

10. يتم تعقيم حلقة على لهب ويتم أخذ حلقة من البكتيريا من كل من المستعمرات التمثيلية بشكل معقم. يتم إدخال حلقة في ممر آغار ، بحيث يذهب حلقة من البكتيريا إلى نهاية الميل. يتم تحريك الحلقة إلى الخارج بطريقة متموجة ملامسة السطح المائل ، بحيث يتم تشكيل خط متموج.

11. يتم تعقيم اللهب وتعقيمه بطريقة مماثلة ، ويتم تطعيم باقي المستعمرات الأربع بشكل منفصل في اليسار على أربع ممرات. يتم تعقيم الحلقة بعد كل عملية تلقيح.

12 - يتم تحضين الحاضنات الخمسة الملقحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الحاضنة.

ملاحظات (الخصائص الثقافية):

(ط) خط متموج مع نمو على طول ملاحظته:

لقد حدث النمو.

لوحظ الميل للخصائص المائلة على النحو التالي (الشكل 6.5).

1. وفرة النمو:

يتم تحديد مقدار النمو على أنه لا شيء ، طفيف ، متوسط ​​أو كبير.

2. تصبغ:

قد تنتج الكائنات الحية الدقيقة الناشئة عن الصباغ صبغات داخل الخلايا مسؤولة عن تلوين الكائن الحي كما يُرى في المستعمرات السطحية. تنتج الكائنات الحية الأخرى صبغات قابلة للذوبان خارج الخلية تفرز في الوسط وتنتج لونًا أيضًا. ومع ذلك ، فإن معظم الكائنات الحية غير كروميرية وستظهر بيضاء إلى رمادية.

3. الخصائص البصرية:

يمكن تقييم الخصائص البصرية على أساس كمية الضوء المنقولة من خلال النمو.

يتم وصف هذه الخصائص على النحو التالي:

(ا) غير شفاف: لا يوجد ناقل حركة خفيف.

(ب) شفافة: انتقال الضوء الجزئي.

(ج) شفاف: انتقال الضوء الكامل.

4. النموذج:

يتم تعيين ظهور خط واحد من خط النمو على سطح الآجار على النحو التالي:

(ا) نموذجية: نمو مستمر متشابك مع حواف ناعمة.

(ب) إيشينولات: نمو مستمر متشابك مع حواف غير منتظمة.

(ج) مطرز: غير متموجة لمستعمرات شبه متموجة.

(د) تأثير: رقيقة ، وانتشار النمو.

(ه) مشبوه: نمو شبيه بالشجر.

(و) رهيني: نمو شبيه بالجذر.

(ثانيا) لا نمو على طول خط التلقيح:

تقنية التطعيم المعيبة ، يتكرر التطعيم C تعداد البكتيريا.

تعداد البكتيريا:

مدى النشاط البكتيري في عينة معينة في مجموعة محددة من الحالات يعتمد بشكل رئيسي على العدد الكلي للبكتيريا الموجودة فيها بغض النظر عن نوعها. ولذلك ، فإنه من المطلوب في كثير من الأحيان معرفة العدد الإجمالي للبكتيريا الموجودة في عينات الطعام والماء والتربة والهواء والنسيج أثناء تحليلها الميكروبيولوجي.

تقدير عدد البكتيريا في عينة معينة يسمى "تعداد البكتيريا". هناك طرق مختلفة لتعداد البكتيريا على النحو المبين أدناه. كل هذه الطرق تحتاج للبكتيريا لتكون موجودة في نظام تعليق متجانس.

هذا هو السبب في افتراض أن العينات السائلة هي عبارة عن معلقات متجانسة للبكتيريا وتستخدم مباشرة ، في حين يتم تجانس العينات الصلبة في المحاليل الملحية المعقمة ، وذلك للحصول على معلقات متجانسة للبكتيريا.

لا تستخدم عادة:

(ط) طرق مباشرة:

(أ) العد المجهري المباشر

(ب) عداد الخلايا الإلكترونية

(ثانيا) الطرق غير المباشرة:

(ج) الطرق الكيميائية

(د) طريقة التعكر

(ه) عدد المرشحات الغشائية

الأكثر استخداما:

(و) طريقة تصفيح أجار التخفيف المتسلسل أو طريقة تعداد اللوحة الكلية (طريقة TPC)

(أ) العد المجهري المباشر:

في هذه الطريقة ، يتم عد عدد البكتيريا الموجودة في قسامة من تعليق البكتريا المتجانسة مباشرة تحت المجهر ، ويتم تحديد العدد الكلي للبكتيريا في العينة رياضياً.

ميزة هذه الطريقة هي أنها سريعة جدا. تتمثل العيوب في أنه يتم حساب كل من الخلايا الحية (القابلة للحياة) والخلايا الميتة ، كما أن الطريقة غير حساسة بالنسبة لعدد أقل من مليون بكتيريا في المليلتر الواحد.

يمكن إجراء العد بطريقتين على النحو التالي:

(1) غرفة Petroff-Hauser:

وهي عبارة عن غرفة عد متخصصة ، حيث يتم وضع قسامة من تعليق البكتريا المتجانسة للعد مباشرة تحت المجهر.

(ثانيا) تسمير تسمير:

تحسب خلايا البكتيريا مباشرة تحت المجهر باستخدام مسحات ملوثة محصورة في مساحة 1 ملم 2 على الشريحة. وهي تستخدم أساسا لتعداد البكتيريا في الحليب.

(ب) عداد الخلايا الإلكترونية:

يتم استخدام عداد خلية إلكترونية مثل "عداد كولتر" لحساب عدد خلايا البكتيريا مباشرةً. يسمح للتعليق المتجانس لخلايا البكتريا التي يتم تحضيرها في مائع موصل بالمرور خلال فتحة دقيقة ، يتدفق عبرها تيار كهربائي.

يتم تسجيل المقاومة عند الفتحة إلكترونيًا. عندما تمر خلية من خلال فتحة ، كونها غير موصل ، فإنه يزيد من المقاومة للحظات. يتم تسجيل عدد مرات زيادة المقاومة للحظات إلكترونيا ، مما يشير إلى عدد البكتيريا الموجودة في التعليق.

ميزة هذه الطريقة هي أنها سريعة للغاية. تتمثل العيوب في أنه يتم حساب كل من الخلايا الحية (القابلة للحياة) والخلايا الميتة ولا يمكن للأداة التمييز بين خلايا البكتيريا والجسيمات الخاملة.

(ج) الطرق الكيميائية:

هذه الأساليب تقدير كمية هذه المواد ، وخاصة المواد الكيميائية ، والتي تزيد مع زيادة في عدد البكتيريا.

المعلمات الرئيسية المقدرة هي كما يلي:

(ط) تركيز البروتين

(ثانيا) تركيز الحمض النووي

(ج) الوزن الجاف

(4) إنتاج ثاني أكسيد الكربون

(ت) امتصاص الأوكسجين

(6) إنتاج حامض اللبنيك

(د) طريقة التعكر:

فعندما تزرع البكتيريا في وسائط غنية بالمغذيات السائلة (مثل مرق المغذيات) ، فإن نموها المفاجئ يجعل وسائط الإعلام عكرة ، حيث تظل خلايا البكتيريا معلَّقة فيها. يزيد التعكر مع زيادة عدد الخلايا في الوسائط. مع زيادة العكارة ، يزيد "الامتصاص" أو "الكثافة البصرية (OD)" للوسائط.

يتم قياس OD لتعليق خلايا البكتيريا في وسائل الإعلام باستخدام مقياس الطيف الضوئي في 600 نانومتر. تم العثور على عدد من خلايا البكتيريا في التعليق من خلال مقارنة OD مع منحنى قياسي أعدت من خلال التآمر قيم التطوير التنظيمي لتركيزات مختلفة من البكتيريا المعروفة. هذه الطريقة سريعة ، ولكنها تقتصر على المعلقات البكتيرية لأكثر من 10 مليون خلية.

(هـ) عدد المرشحات الغشائية:

يتم استخدام هذه الطريقة ، عندما يكون عدد البكتيريا في عينة سائلة أقل من ذلك بكثير. لزيادة تركيز البكتيريا ، يتم أولاً تصفية عينة السائل عن طريق معقم مطهر من خلال جهاز تصفية غشاء معقم باستخدام مرشح غشاء معقم.

يتم نقل مرشح الغشاء الذي يحتوي على البكتيريا المحاصرة بطريقة معقمية إلى طبق بتري معقم يحتوي على وسادة ماصة مشبعة بوسيط سائل انتقائي تفاضلي. الوسيط يتدفق على سطح الفلتر. بعد الحضانة ، يتم حساب عدد المستعمرات التي تكونت على الفلتر باستخدام مجهر بسيط.

(و) طريقة الطلاء بالتخسيس المتزامن أو طريقة TPC:

هو الأسلوب الأكثر تنوعا واستخداما على نطاق واسع لتعداد البكتيريا.